用重叠延伸PCR连接片段为什么不出目的条带？

2024-12-04 07:21:08

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回答（1）：

因为概率太低了,建议你程序先设置成五个循环94,68,72,时间自定,然后再接正常的PCR循环30个overlapping有好多种做法呢，你试试看不用取出反应液的办法吧，就是我回答里的那五个循环首先，配置体系，酶和引物都加，然后，把第一步所得的三条片段尽量等浓度混合，量大一些，当做模板。然后，设置双重循环的PCR程序，先按我说的，68℃那个，五个循环，专门连接他们的缺口；接着是普通的PCR了，退火时间，最好设置成一分钟，延伸时间设置成五分钟，三十个循环。接下来你都会啦~~ 我的建议是，配100微升体系哈，这三个片段，如果第一步PCR产率一样的话……胶回收用20微升溶解，各取10微升总共30微升做模板！这样如果你的引物特异性好的话，没问题的一定能做出来特异性不好的话，果断重新设计。比如我师兄的引物，就很不好。

回答（2）：

最后问题解决了吗？