TA克隆出现假阳性的原因有哪些?

首先，你的假阳性的定义是什么呢？是板上长了菌落，而且是白色的，但是里面没有插入片段的意思吗？以下是在这个定义基础上进行的讨论。
第一， TA克隆的自身环化是造成这种现象的最主要原因，根据我的经验，不同公司提供的TA载体的自身环化率在20%到50%之间。这个比例可以通过优化连接反应的条件进行改善。无非就是提高反应体系中目的基因片段的含量，通常DNA:TA载体大概应在1：3左右，加入更多片段可以显著提高链接的效率。再就是提高DNA片段的纯度，减少其中的杂质，这需要通过改进DNA凝胶纯化的方法来实现。QIAGEN的凝胶纯化试剂盒非常好。常量高纯度也好。
第二， 除了自身环化之外就是在PCR产物不纯，里面还有引物等小片段，这些东西更容易与TA载体链接，最后进行酶切鉴定时又看不到插入片段。这一般不容易发生，有的人喜欢用柱子纯化PCR产物，我则习惯跑胶后纯化，这样PCR产物和引物等已经完全分离，则不会发生这种情况。
第一点是最主要的，改善链接反应后可以将假阳性的比例降至极低，前段时间我克隆了10个基因，每板挑取4个克隆，其中8个基因的片段插入率都能达到100%。另2两也能达到75%。选用高质量的TA和凝胶纯化试剂盒是关键。推荐QIAGEN的凝胶纯化和PROMEGA的TA克隆。

大片段的连接要加大PCR产物的浓度 连接时间可以适当延长

但是连接时间较长 有时载体会自连造成假阳性