琼脂糖凝胶电泳具体操作步骤是什么？需要注意什么事项？

如何配制电泳时需要的凝胶，各种物品的比例是什么？

2024-11-15 02:50:31

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回答（1）：

一、操作步骤：

1、电泳方法

一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。

2、凝胶浓度

对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。

3、缓冲液

常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。

4、电压和温度

电泳时电场强度不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。

5、DNA样品的纯度和状态

注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。

6、DNA的上样

正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。

7、Marker的选择

DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。

8、凝胶的染色和观察

实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。

二、注意事项：

1、巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。

2、高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。

3、电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

4、如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象。

5、变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。

6、太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。

扩展资料

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。

但由于其孔径相比于蛋白质太大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。

琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。

参考资料来源：百度百科-琼脂糖凝胶电泳

回答（2）：

一。操作步骤：

1、电泳方法

2、凝胶浓度

3、缓冲液

常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。

4、电压和温度

电泳时电场强度不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。

5、DNA样品的纯度和状态

注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。

6、DNA的上样

正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。

7、Marker的选择

8、凝胶的染色和观察

二、注意事项：

1、巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。

2、高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。

3、电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

4、如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象。

5、变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。

6、太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。

参考资料来源：百度百科-琼脂糖凝胶电泳

回答（3）：

这是我做病毒检测实验试剂盒的说明书部分，看是否对你有帮助：
配制1%的胶进行电泳
1 称取0.4g琼脂糖放于锥形瓶中，再量取40ml的0.5×TBE溶液混合，放于微波炉中煮沸，至溶液清彻透明为止，大约需1分40秒。
2 冷却到60℃时（放于掌心，能感觉到汤但又能忍受。）加2μl核酸染料，摇匀。
3 组装好制胶器，并调至水平。将胶倒于制胶器中，插好梳子。待40分钟胶冷却凝固后，就可放于倒好电泳缓冲液的电泳槽中进行点样。
4 取5-10μl样品溶液，加1-2μl 6×loading Dye，混合均匀后进行点样。每排点样孔要点一个5μl的Marker。
5 点完后，调电泳仪各参数进行电泳：U：80V；A；200A；T：40min。

电泳结束，凝胶成像系统观察结果。

做实验需要注意的一点就是要戴手套操作，保护好自己。像如果用的核酸染料是EB、缓冲液是TAE的话，就要更加小心了，那玩意儿致癌性比较强；像我们用的是GoldViewTM 核酸染料和TAE还不是特别要紧。
还有就是，这里说的40ml制的一般都是25孔的中胶，你要根据所需要的孔数来按比例调节用量。胶不能制的太厚或者太薄，二者都不利于电泳的。
煮胶的时候，一定要让胶完全溶解（拿起来对着光照看，没有亮亮的小点出现），不然跑出来的胶不好看；煮的时间也不能太长，煮久了对样品的回收这类的可能有影响的。

回答（4）：

1.选择合适的Marker
2. 配胶的缓冲液与电泳缓冲液要是同一种，且浓度一致（1倍）
3. 点样时要加入loading buffer，并注意，不要将样点到点样孔之外（飘样），也不要将胶戳漏（漏样）
4. 根据片段大小，及电泳检测目的，选择合适的电压及电泳时间
5. EB染色。可选择制胶时加入EB（要在溶玩胶后，且温度至室温时（用手握住制胶容器，不烫手即可））；或电泳结束后，将胶放入EB溶液中染色。

回答（5）：

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