pcr 第一次做能跑出来，第二次再做同样的怎么都跑不出来，有时候暗，有时候亮带都没有

2024-11-27 06:47:07

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回答（1）：

做pcr，要时刻记着这6个：模板，引物，taq酶，dNTP，mg2+，温度及其他条件控制。
设计实验围绕的是这6个中心环节，而troubleshooting也要从这6个方面入手，一项项排查
孔的大小应该不会是造成条带问题的原因。建议你筛查一遍，从污染、操作顺序、加量多少等分别排查，是否有不当之处。

回答（2）：

个人觉得，以前能够做出来，说明操作没有问题，反应体系也没有问题，但是后来做不出来，主要考虑两个因素：模板是否降解？dNTP是否出问题（我们实验室的也碰到类似问题，换新的dNTP就好了）

回答（3）：

你说的小孔和中空是反应体系（PCR终体积）吗，如果是的话，我觉得啊，你的体系放大可能有问题。好多实验在小体系中，某种因素的影响可能很小，小到可以忽略，但放大后就影响很明显。你可以用大体系进行优化，针对楼上的各种可能原因，设计些梯度，进行摸索。希望能帮到你。