pcr退火温度怎么确定?

熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。 有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃
或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

计算退火温度的方法：
1. 退火温度＝4×（G＋C）＋2×（A＋T）－（5～8） 只是粗算，有时不灵，但比较简便。
2.用primer5（or oligo6）计算，引物配对好后，primer5可以显示Tm，我认为这个值就是退火温度，我的经验再加2 or 3度最好。
3.合成引物的单子上也有个Tm，减去5～8也可，但有些公司提供的Tm就是方法1计算的。
我认为方法二最准确，不知道还有其他方法吗？

我是采用primer5软件推荐的Tm值作为退火温度的，基本都是可行的。如果PCR结果不好，可以上下浮动几度进行梯度PCR进行退火温度的优化。