什么是胚胎冷冻

三步平衡法

（1）10%甘油保存液的配制

取9毫升20%羊血清的PBS，加入1毫升甘油，用吸管反复混合15～20次，经0.22微米滤器过滤到灭菌器内待用。

（2）取含20%羊血清0.3摩尔蔗糖的PBS 2毫升和3.5毫升，分别加入10%甘油3毫升和1.5毫升，配成含6%和3%甘油的蔗糖冷冻液。将3%、6%和10%三种甘油浓度的冷冻液分别装入小培养皿。

（3）胚胎分别在3%、6%和10%甘油的冷冻液中浸5分钟。

（4）胚胎装管

用0.25毫升塑料细管按以下顺序吸入，少量的10%甘油的PBS液、气泡、10%甘油的PBS液（含有胚胎）、气泡、少量的10%甘油的PBS液，加热封口两道（图9-18）。

图9-18 胚胎装管示意图

（5）塑料细管的编号

剪一段（2厘米）0.5毫升塑料细管作为标记外套，内装色纸，注明供体品种、耳号、胚胎发育阶段及等级、制作日期（年、月、日），并在外套管上写明序号备查。

（6）冷冻程序

将细管直接浸入冷冻仪的酒精浴槽内，以1℃/分钟的速度从室温降至-6℃，停5分钟后植冰，再停留10分钟，以0.3℃/分钟的速度降至-36℃，再以0.1℃/分钟的速度降至-38℃，直接投入液氮，长期保存。

（7）冷冻胚胎的解冻

①解冻液的配制 根据上文所述配制出10%、6%和3%甘油的蔗糖解冻液，用0.22微米过滤器灭菌，分装在小培养皿内，第1～4杯分别为10%、6%、3%、0%甘油的蔗糖解冻液，第5杯为PBS保存液。

②胚胎的解冻 胚胎从液氮中取出，在3秒钟内投入38℃水浴，浸10秒钟。

③三步脱甘油 用70%酒精棉球擦拭塑料细管和剪刀刃，剪去棉塞端，与带有空气的1毫升注射器连接。再剪去细管的另一端，在室温下将胚胎推入10%甘油和0.3摩尔蔗糖的PBS解冻液中，放置5分钟后依次移入6%、3%和0%甘油的蔗糖PBS解冻液中，各停留5分钟，最后移至PBS保存液中镜检待用。

胚胎冷冻是用超低温的方法将胚胎进行长期保存的技术。冷冻过程主要包括两个因素，一是冷冻保护剂，能够在冷冻的过程中保护胚胎细胞，预防或减轻冷冻损伤的物质。冷冻保护剂通常由一系列不同浓度的保护剂组成。第二是严格复杂的操作程序，使用冷冻保护剂，并按照操作步骤对胚胎进行冷冻前的处理，将保护剂逐渐渗透入胚胎的细胞中，使胚胎能够承受即将出现的温度急剧降低的过程而不受到损伤，经过一系列的操作程序后，胚胎可达到合适冷冻的状态，即可将它们放置在-196℃的液氮环境中进行长时间的保存，胚胎冷冻可以在精子和卵子正常结合形成胚胎以后的各个时期进行。在日常的工作中，多数实验室主要会选择两个时间段来进行此项工作，一个是取卵后第3天进行卵裂期的胚胎冷冻，另一个是取卵后5-7天进行囊胚期的胚胎冷冻，具体选择哪个时间段冷冻更加合适，需观察胚胎的质量、数量，以及每个患者自身的情况来进一步确定，患者身体各方面条件都合适时，胚胎学家会采用适当的解冻方法，将冷冻胚胎恢复至正常的生理温度，然后将它们移植进子宫腔中，发育成胎儿，胚胎冷冻保存技术已经成为辅助生殖技术中的重要组成部分。

冷冻胚胎在零下196℃的环境下，代谢是完全停止的，因此，理论上胚胎可以永久保存。现在的冷冻技术都十分成熟，冷冻胚胎可以使其得到长时间的保存，目的是为了在以后的治疗周期中不再诱发排卵，仅通过移植复苏胚胎获得妊娠，既节约费用，又在最大限度上利用胚胎。

胚胎冷冻是将胚胎和冷冻液装入冷冻管中，经过慢速（第2-3天的胚胎）和快速（第5-6天的囊胚）两种降温方式使胚胎能静止下来并可在-196度的液氮中保存的一种方法。