PCR程序中的退火温度和循环次数受哪些因素影响

2024-11-15 13:10:29

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回答（1）：

退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

回答（2）：

退火温度基本和引物有关，如果产物特异性不好，可以适当提高退火温度。
循环次数是你自己定的，如果模板量低（产物量少）就多循环几圈，不过最好别超过35个，里边的成分都耗损的差不多了。再循环也没大用了。