如何养293、293T系列的细胞？

2025-03-04 18:22:16

推荐回答（4个）

回答（1）：

将细胞培养瓶竖立放置，吸走培养基，如果培养基中的脱落细胞较多，说明细胞现在很容易脱落，只要加入1ml的PBS+EDTA(0.02%)，来回轻微晃动培养瓶直到细胞完全脱落，加入10mlMEM，混匀，不能吹打，分装2瓶。

如果细胞没长满就脱落，则只需加入5mlMEM，不分装。如果培养瓶中的细胞贴壁较牢固，培养基上清没有细胞脱落碎片，且细胞长满达到80％以上，吸走培养基，加入5ml的PBS+EDTA(0.02%)，迅速轻微晃动，竖立培养瓶，吸走，加入1ml0.05%胰酶，37度消化不超过3min。

扩展资料：

注意事项：

1、尽量用早期的细胞，传代太多状态不好，产毒也不好，贴壁困难。

2、塑料的瓶子，DMEM +10%的小牛血清即可，要求并不高，ATCC上有详细的培养方法。

3、主要是传代，胰酶消化点到即止，不能和其它成纤维细胞一样。

4、细胞代数越高生长越快，同时性状和原代差别也更大。一般2-3天传代一次比较合适。

5、传代时细胞密度在80%左右比较好，如果超过90%融合再传会影响细胞状态。

参考资料来源：百度百科-293细胞

回答（2）：

1. 养293细胞和293T一样。以293T为例，预先准备3个T150瓶的293T细胞，培养基为DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-链霉素。

2. 将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是8×106个。

3. 第二天，镜下检查细胞。细胞融合度应大致为30-40%，分布均匀。

4. 转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入20ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。

5. 取两支无菌的50ml离心管，其中一支中加入252 μg pNL-EGFP/CMV/WPREDU3 载体质粒，168 μg pCD/NL-BH*DDD
包装质粒和84 μg pLTR-G质粒，用Opti-MEM培养基补齐到18ml。另一支中加入500 µl Trans-EZ溶液和17.5 ml
Opti-MEM培养基，用电动移液器轻轻混匀。将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。

关键步骤：推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。

6. 室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体。

7.
取1支5ml的移液管，将得到的DNA-Trans-EZ复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板3ml。来回晃动培养板，混匀后放回到5%二氧化碳培养箱。每一皿细胞培养盘不要超过6盘。

8. 6小时后，移去细胞上清，更换为17ml的DMEM完全培养基。

9.
转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近60-80%。如果所转染质粒带有GFP荧光，那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。

10. 将细胞送回培养箱继续培养2天（36-48小时）。在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。

11. 收集所有的上清，分装到50ml离心管中。

12 4℃，500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。

13 总的上清约为204 ml，用250-ml 0.45 μm PVDF过滤装置过滤。如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。

回答（3）：

跟养其他细胞是一样，不过293T细胞聚集成的形状会是树突状细胞一样的形态。
包装细胞293T细胞的培养

一、293T细胞的冻存

1.
随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
2.
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4.
加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6.
细胞计数。
7. 将细胞离心，1000rpm，2min。
8.根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+ 20% FBS
+ 10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
9.
分装进细胞冻存管，放入泡沫盒中，放入-80℃超低温冰箱。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
11.
复苏检测细胞存活率，细胞状态等，并记录。

二. 293T细胞的传代

1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2.
消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。
4.
分到10cm培养皿中，10ml/皿。
5.
放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。

三. 293T细胞的复苏

1.
当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2.
打开水浴锅，设置温度为40℃。
3.
查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2
min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5.
放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6.
第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。

用于包装的293T细胞的培养

用于包装的293T细胞(ATCC No.
CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。任何时候细胞汇合率都不准达到100%。

慢病毒的包装

1. 预先准备3个T150瓶的293T细胞，培养基为DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-链霉素。

2. 将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是8×106个。

3. 第二天，镜下检查细胞。细胞融合度应大致为30-40%，分布均匀。

4. 转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入20ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。

5. 取两支无菌的50ml离心管，其中一支中加入252 μg pNL-EGFP/CMV/WPREDU3 载体质粒，168 μg pCD/NL-BH*DDD
包装质粒和84 μg pLTR-G质粒，用Opti-MEM培养基补齐到18ml。另一支中加入500 µl Trans-EZ溶液和17.5 ml
Opti-MEM培养基，用电动移液器轻轻混匀。将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。

关键步骤：推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。

6. 室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体。

7.
取1支5ml的移液管，将得到的DNA-Trans-EZ复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板3ml。来回晃动培养板，混匀后放回到5%二氧化碳培养箱。每一皿细胞培养盘不要超过6盘。

8. 6小时后，移去细胞上清，更换为17ml的DMEM完全培养基。

9.
转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近60-80%。如果所转染质粒带有GFP荧光，那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。

10. 将细胞送回培养箱继续培养2天（36-48小时）。在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。

11. 收集所有的上清，分装到50ml离心管中。

12 4℃，500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。

13 总的上清约为204 ml，用250-ml 0.45 μm PVDF过滤装置过滤。如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。

回答（4）：

Protocol: 1. Remove and discard culture medium.
2.Briefly rinse the cell layer with 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA solution to remove all traces of serum that contains trypsin inhibitor.
3.Add 2.0 to 3.0 ml of Trypsin-EDTA solution to flask and observe cells under an inverted microscope until cell layer is dispersed (usually within 5 to 15 minutes).
Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the cells to detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37°C to facilitate dispersal.
4.Add 6.0 to 8.0 ml of complete growth medium and aspirate cells by gently pipetting.
5.Add appropriate aliquots of the cell suspension to new culture vessels.
6. Incubate cultures at 37°C.

Subcultivation Ratio: A subcultivation ratio of 1:4 to 1:8 is recommended
Medium Renewal: Every 2 to 3 days

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