如何证明是否mRNA反转录cDNA第一链成功
有反转录酶，可以以RNA为模版合成DNA。
这过程需要引物，根据mRNA有3‘polyA尾巴的特点,可以用oligo-dT作为引物，合成cDNA,这样可以自然去除非mRNA的RNA的转录。
也可以用随机引物去合成大量不同的cDNA。
如果要反转录特定的mRNA，就根据它设计特异性引物反转录，这样理论上只有目的cDNA产生。
逆转录生成单链DNA和MRNA的杂交链 后来单链DNA在与游离的核苷酸合成双链
mRNA反转录形成cDNA的步骤如下：
将mRNA置于PCR仪中，经过95度变性、72度延伸、Tm温度退火，来回30~35个回圈，最后4度就能得到反转录的cDNA。
DTT 上的巯基可以保护逆转录所用酶的二硫键，增加蛋白稳定性。还是加吧~
是单链cDNA，想合成双链cDNA需要另外操作：
一、cDNA第二链的合成:
1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中储存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):
20ul 10×DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP(自己配制)
xul dd H2O
1ul RNase H(2U/ul)
10ul DNA Polymerase I(10U/ul)
总体系为200ul;
2. 混匀后,16℃反应2.5小时;
3. 70℃灭活10分钟;
4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5．取2ul二链产物，同储存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。
注：一链，二链的电泳图是 *** ear，且二链稍比一链大一些。
二、双链cDNA末端补平:
1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)
2ul BSA(10mg/ml)
2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程：
1．溶液PE使用前应加入适量体积95％－100％的乙醇，混匀。
2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。
3．加入spin column中，13000rpm离心1min。
4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。
5．13000rpm，再离心1min。
6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。
7．13000rpm离心2min。
8．加入30ul buffer EB，静置10min。
9．13000rpm离心2min。
10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。
有反转录酶，可以以RNA为模版合成DNA。
这过程需要引物，根据mRNA有3‘polyA尾巴的特点，可以用oligo-dT作为引物，合成cDNA，这样可以自然去除非mRNA的RNA的转录。
也可以用随机引物去合成大量不同的cDNA。
如果要反转录特定的mRNA，就根据它设计特异性引物反转录，这样理论上只有目的cDNA产生
cDNA是互补DNA，它是由RNA转录来的，人工合成法包括反转录法和化学合成法
mRNA反转录形成cDNA 大致分为哪些步骤
有反转录酶，可以以RNA为模版合成DNA。
这过程需要引物，根据mRNA有3‘polyA尾巴的特点,可以用oligo-dT作为引物，合成cDNA,这样可以自然去除非mRNA的RNA的转录。
也可以用随机引物去合成大量不同的cDNA。
如果要反转录特定的mRNA，就根据它设计特异性引物反转录，这样理论上只有目的cDNA产生。
先从细胞提取总RNA，然后根据大多数真核mRNA含有多聚腺嘌呤（polyadenylic acid ,polyA）尾的特点，用寡聚dT纤维素柱将mRNA分离出，以mRNA为模板，在多聚A尾上结合12－18个dT的寡聚dT片段，作为合适的起始引物，在逆转录酶作用下合成
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