rt pcr的扩增检测需要首先经过什么程序后才能进行pcr循环？

1、PCR引物设计

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的基本原则：引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

引物内部不应出现互补序列。两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

引物3′端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

2、模板的制备

PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

详细流程如下:
1、数据库查找并下载目的基因序列;
2、在线软件或者软件设计引物，并blast引物特异性，引物合成;
3、PCR引物调试，通过扩增曲线和溶解曲线判断引物质量;
4、样本反转录，并稀释成上样浓度;
5、所有样本连同内参一起荧光定量PCR检测
6、数据处理得到内参及指标之间的数据关系
7、得出基本结论。
从以上流程来看，RT-PCR的主要步骤是引物合成、反转录、PCR上机三个步骤，我们需要细拆分总结其中的关键步骤从而简化整个流程。

不同点很多。最简介回答，是目的不同，侧重点也不同：

1. 普通pcr。只考虑能不能扩增出来就行。
   

2. rtpcr。上荧光的话，对引物质量要求高，得做个hplc或者page纯化；其次对引物设计要求高，考虑得率，特异性等因素。

3. 克隆引物。考虑加入常见酶切位点，导入何种目的载体，碱基密码子偏好性等。